Esegui le best practice GATK

Nota: questo tutorial mostra come eseguire un flusso di lavoro predefinito in un caso d'uso con limitazioni, ma non è pensato per essere eseguito in produzione.

Questa pagina spiega come eseguire una pipeline di analisi genomica secondaria su Google Cloud utilizzando le best practice di Genome Analysis Toolkit (GATK). Le best practice di GATK sono fornite dal Broad Institute.

Il flusso di lavoro utilizzato in questo tutorial è un'implementazione delle best practice di GATK per la scoperta di varianti nei dati di sequenziamento dell'intero genoma (WGS). Il flusso di lavoro è scritto nel linguaggio di definizione del flusso di lavoro (WDL) del Broad Institute e viene eseguito sul runner WDL Cromwell.

Nota: sei responsabile del rispetto dei termini del Contratto di licenza per gli utenti finali di GATK, incluso il requisito di attribuzione.

Obiettivi

Al termine di questo tutorial saprai come:

• Esegui una pipeline utilizzando le best practice di GATK con i dati della build 38 del genoma di riferimento umano
• Esegui una pipeline utilizzando le best practice di GATK con i tuoi dati

Costi

In questo documento utilizzi i seguenti componenti fatturabili di Google Cloud:

• Compute Engine
• Cloud Storage

Per generare una stima dei costi in base all'utilizzo previsto, utilizza il Calcolatore prezzi. I nuovi utenti di Google Cloud potrebbero essere idonei per una prova gratuita.

Prima di iniziare

1. Sign in to your Google Cloud account. If you're new to Google Cloud, create an account to evaluate how our products perform in real-world scenarios. New customers also get $300 in free credits to run, test, and deploy workloads.

2. In the Google Cloud console, on the project selector page, select or create a Google Cloud project.

   Note: If you don't plan to keep the resources that you create in this procedure, create a project instead of selecting an existing project. After you finish these steps, you can delete the project, removing all resources associated with the project.

   Go to project selector

3. Make sure that billing is enabled for your Google Cloud project.

4. Enable the Cloud Life Sciences, Compute Engine, and Cloud Storage APIs.

   Enable the APIs

5. Install the Google Cloud CLI.

6. To initialize the gcloud CLI, run the following command:

   gcloud init

7. Update and install gcloud components:

   gcloud components update
   gcloud components install beta

8. In the Google Cloud console, on the project selector page, select or create a Google Cloud project.

   Note: If you don't plan to keep the resources that you create in this procedure, create a project instead of selecting an existing project. After you finish these steps, you can delete the project, removing all resources associated with the project.

   Go to project selector

9. Make sure that billing is enabled for your Google Cloud project.

10. Enable the Cloud Life Sciences, Compute Engine, and Cloud Storage APIs.

    Enable the APIs

11. Install the Google Cloud CLI.

12. To initialize the gcloud CLI, run the following command:

    gcloud init

13. Update and install gcloud components:

    gcloud components update
    gcloud components install beta

14. Installa git per scaricare i file richiesti.

    Scaricare git

15. Per impostazione predefinita, Compute Engine ha implementato quote delle risorse per evitare un utilizzo involontario. Aumentando le quote, puoi avviare più macchine virtuali contemporaneamente, il che aumenta il throughput e riduce i tempi di risposta.

    Per ottenere risultati ottimali in questo tutorial, devi richiedere una quota aggiuntiva superiore a quella predefinita del progetto. Nel seguente elenco sono riportati i consigli per gli aumenti di quota e le quote minime necessarie per eseguire il tutorial. Invia le richieste di quota nella regione us-central1:

    • CPU: 101 (minima 17)
    • Disco permanente standard (GB): 10.500 (min 320)
    • Indirizzi IP in uso: 51 (min 2)

    Puoi lasciare vuoti gli altri campi di richiesta di quota per mantenere le quote attuali.

    Nota: se il progetto è stato creato utilizzando la prova gratuita, devi richiedere quote più elevate per eseguire le best practice GATK su Google Cloud.

Crea un bucket Cloud Storage

Crea un bucket Cloud Storage utilizzando il comando gcloud storage buckets create. A causa di un requisito dell'engine Cromwell, non utilizzare il carattere trattino basso (_) nel nome del bucket, altrimenti si verificherà un errore.

gcloud storage buckets create gs://BUCKET

La pipeline restituisce risultati, log e file intermedi in questo bucket.

Scarica i file di esempio

Esegui i seguenti comandi per scaricare lo script WDL e di supporto:

git clone https://github.com/broadinstitute/wdl-runner.git
git clone https://github.com/gatk-workflows/broad-prod-wgs-germline-snps-indels.git

Il repository gatk-workflows/broad-prod-wgs-germline-snps-indels contiene i seguenti file necessari per eseguire la pipeline:

• *.wdl: definizione del flusso di lavoro
• *.inputs.json: parametri di input, inclusi i percorsi dei file BAM e del genoma di riferimento
• *.options.json: opzioni di runtime del flusso di lavoro

Puoi trovare il file di definizione della pipeline Cromwell utilizzato per eseguire le pipeline WDL nel repository broadinstitute/wdl-runner/wdl_runner/.

Esegui la pipeline utilizzando dati di esempio

Questa sezione mostra come eseguire la pipeline con i dati WGS utilizzando la build 38 del genoma di riferimento umano. I file di input sono file BAM non allineati.

Per eseguire la pipeline, completa i seguenti passaggi:

1. Crea la variabile di ambiente GATK_GOOGLE_DIR che indichi la cartella contenente i file della pipeline Broad:

   export GATK_GOOGLE_DIR="${PWD}"/broad-prod-wgs-germline-snps-indels

2. Crea la variabile di ambiente GATK_OUTPUT_DIR che punta al bucket Cloud Storage e a una cartella per i output del flusso di lavoro, i file work intermedi e logging:

   export GATK_OUTPUT_DIR=gs://BUCKET/FOLDER

3. Cambia la directory impostandola sulla cartella /wdl_runner nel repository che hai scaricato. Questa directory contiene il file di definizione della pipeline per l'esecuzione di pipeline basate su WDL su Google Cloud:

   cd wdl-runner/wdl_runner/

4. Esegui la pipeline:

   Importante: se viene visualizzato il messaggio di errore "ERROR: (gcloud.beta.lifesciences.pipelines.run) INVALID_ARGUMENT: Error: validating pipeline: zones and regions cannot be specified together", consulta la sezione Risoluzione dei problemi.

   Scegli una delle seguenti opzioni a seconda che tu stia utilizzando un VPC predefinito o un VPC personalizzato:

   VPC predefinita

   gcloud beta lifesciences pipelines run \
   --pipeline-file wdl_pipeline.yaml \
   --location us-central1 \
   --regions us-central1 \
   --inputs-from-file WDL=${GATK_GOOGLE_DIR}/PairedEndSingleSampleWf.wdl,\
   WORKFLOW_INPUTS=${GATK_GOOGLE_DIR}/PairedEndSingleSampleWf.hg38.inputs.json,\
   WORKFLOW_OPTIONS=${GATK_GOOGLE_DIR}/PairedEndSingleSampleWf.options.json \
   --env-vars WORKSPACE=${GATK_OUTPUT_DIR}/work,\
   OUTPUTS=${GATK_OUTPUT_DIR}/output \
   --logging ${GATK_OUTPUT_DIR}/logging/

   VPC personalizzato

   1. Crea le variabili di ambiente NETWORK e SUBNETWORK per specificare il nome della rete e della subnet VPC:

      export NETWORK=VPC_NETWORK
      export SUBNETWORK=VPC_SUBNET

   2. Modifica il file PairedEndSingleSampleWf.options.json nella directory broad-prod-wgs-germline-snps-indels e modifica le zone in modo da includere solo quelle all'interno della regione della tua sottorete. Ad esempio, se utilizzi una sottorete us-central1, il campo zones avrà il seguente aspetto: "zones": "us-central1-a us-central1-b us-central1-c us-central1-f".

   3. gcloud beta lifesciences pipelines run \
      --pipeline-file wdl_pipeline.yaml \
      --location us-central1 \
      --regions us-central1 \
      --network ${NETWORK} \
      --subnetwork ${SUBNETWORK} \
      --inputs-from-file WDL=${GATK_GOOGLE_DIR}/PairedEndSingleSampleWf.wdl,\
      WORKFLOW_INPUTS=${GATK_GOOGLE_DIR}/PairedEndSingleSampleWf.hg38.inputs.json,\
      WORKFLOW_OPTIONS=${GATK_GOOGLE_DIR}/PairedEndSingleSampleWf.options.json \
      --env-vars WORKSPACE=${GATK_OUTPUT_DIR}/work,\
      OUTPUTS=${GATK_OUTPUT_DIR}/output,\
      NETWORK=${NETWORK},\
      SUBNETWORK=${SUBNETWORK} \
      --logging ${GATK_OUTPUT_DIR}/logging/

5. Il comando restituisce un ID operazione nel formato Running [operations/OPERATION_ID]. Puoi utilizzare il comando gcloud beta lifesciences describe per monitorare lo stato della pipeline eseguendo il seguente comando (assicurati che il valore del flag --location corrisponda alla posizione specificata nel passaggio precedente):

   gcloud beta lifesciences operations describe OPERATION_ID \
       --location=us-central1 \
       --format='yaml(done, error, metadata.events)'

6. Il comando operations describe restituisce done: true al termine della pipeline.

   Puoi eseguire uno script incluso con wdl_runner per verificare ogni 300 secondi se il job è in esecuzione, è stato completato o ha restituito un errore:

   ../monitoring_tools/monitor_wdl_pipeline.sh OPERATION_ID us-central1 300

7. Al termine della pipeline, esegui il seguente comando per elencare gli output nel bucket Cloud Storage:

   gcloud storage ls gs://BUCKET/FOLDER/output/

Puoi visualizzare i file intermedi creati dalla pipeline e scegliere quelli da conservare oppure rimuoverli per ridurre i costi associati a Cloud Storage. Per rimuovere i file, consulta l'articolo Eliminare i file intermedi nel bucket Cloud Storage.

Esegui la pipeline di best practice GATK sui tuoi dati

Prima di eseguire la pipeline sui dati locali, devi copiare i dati in un bucket Cloud Storage.

Copia i file di input

La pipeline può essere eseguita con file BAM non allineati archiviati in Cloud Storage. Se i file sono in un formato diverso, ad esempio BAM o FASTQ allineati, devi convertirli prima di poterli caricare su Cloud Storage. Puoi convertirli localmente oppure utilizzare l'API Pipelines per farlo nel cloud.

L'esempio seguente mostra come copiare un singolo file da un file system locale in un bucket Cloud Storage:

gcloud storage cp FILE gs://BUCKET/FOLDER

Per altri esempi su come copiare i file in un bucket Cloud Storage, consulta la sezione sulla copia dei dati in Cloud Storage.

Gcloud CLI verifica automaticamente i checksum, pertanto, se il trasferimento va a buon fine, i dati sono compatibili per l'utilizzo con le Best Practice di GATK.

Esegui la pipeline sui dati

Per eseguire le best practice di GATK sui tuoi file BAM non allineati, crea una copia di PairedEndSingleSampleWf.hg38.inputs.json, quindi aggiorna i percorsi in modo che rimandino ai tuoi file in un bucket Cloud Storage. Poi puoi seguire i passaggi descritti in Eseguire la pipeline utilizzando dati di esempio, utilizzando il file PairedEndSingleSampleWf.hg38.inputs.json aggiornato.

Se i dati non sono costituiti da file BAM non allineati e contengono genomi di riferimento, sequenziamento dell'esoma, panel mirati e dati somatici, devi utilizzare flussi di lavoro diversi. Per ulteriori informazioni, visita il forum di assistenza GATK e il repository GitHub del Broad Institute.

Risoluzione dei problemi

• La pipeline è configurata per utilizzare le istanze Compute Engine in regioni e zone specifiche. Quando esegui l'interfaccia a riga di comando gcloud, viene utilizzata automaticamente una regione e una zona predefinite in base alla posizione in cui è stato creato il progetto Google Cloud. Ciò può comportare il seguente messaggio di errore durante l'esecuzione della pipeline:

  "ERROR: (gcloud.beta.lifesciences.pipelines.run) INVALID_ARGUMENT: Error: validating pipeline: zones and regions cannot be specified together"

  Per risolvere il problema, rimuovi la regione e la zona predefinite eseguendo i comandi seguenti, quindi esegui di nuovo la pipeline:

  gcloud config unset compute/zone
  gcloud config unset compute/region
  

  Per ulteriori informazioni sull'impostazione della regione e della zona predefinite per il progetto Google Cloud, consulta Modificare la zona o la regione predefinita.

• Se riscontri problemi durante l'esecuzione della pipeline, consulta la sezione Risoluzione dei problemi relativi all'API Cloud Life Sciences.

• GATK ha aspettative rigorose sui formati dei file di input. Per evitare problemi, puoi verificare che i tuoi file superino lo strumento ValidateSamFile.

• Se l'esecuzione di GATK non va a buon fine, puoi controllare i log eseguendo il seguente comando:

  gcloud storage ls gs://BUCKET/FOLDER/logging

• Se riscontri errori di autorizzazione, verifica che il tuo account di servizio abbia accesso in lettura ai file di input e in scrittura al percorso del bucket di output. Se stai scrivendo file di output in un bucket di un progetto Google Cloud non di tua proprietà, devi concedere all'account di servizio l'autorizzazione per accedere al bucket.

Pulizia

Eliminazione dei file intermedi nel bucket Cloud Storage

Quando esegui la pipeline, i file intermedi vengono archiviati in gs://BUCKET/FOLDER/work. Puoi rimuovere i file al termine del flusso di lavoro per ridurre i costi di Cloud Storage.

Per visualizzare lo spazio utilizzato nella directory work, esegui il seguente comando. L'esecuzione del comando potrebbe richiedere diversi minuti a causa delle dimensioni degli file nella directory.

gcloud storage du gs://BUCKET/FOLDER/work --readable-sizes --summarize

Per rimuovere i file intermedi nella directory work, esegui il seguente comando:

gcloud storage rm gs://BUCKET/FOLDER/work/**

Elimina il progetto

Il modo più semplice per eliminare la fatturazione è quello di eliminare il progetto utilizzato per il tutorial.

Per eliminare il progetto:

Avviso: l'eliminazione di un progetto ha le seguenti conseguenze:

• Se hai utilizzato un progetto esistente, eliminerai anche tutto il lavoro effettuato nel progetto.
• Non puoi riutilizzare l'ID di un progetto eliminato. Se hai creato un ID personalizzato che hai intenzione di utilizzare in futuro, elimina le risorse all'interno del progetto. Questo passaggio garantisce che gli URL che utilizzano l'ID del progetto, ad esempio un URL appspot.com, rimangano disponibili.

Se stai esplorando più tutorial e guide di avvio rapido, puoi riutilizzare i progetti invece di eliminarli, in modo da non superare i limiti di quota.

1. Nella console Google Cloud, vai alla pagina Progetti.

   Vai alla pagina Progetti

2. Nell'elenco dei progetti, selezionare quello da eliminare e fai clic su Elimina progetto.
3. Nella finestra di dialogo, digita l'ID del progetto e fai clic su Chiudi per eliminare il progetto.

Passaggi successivi

• Il sito GATK e i forum del Broad Institute forniscono maggiori informazioni di sfondo, documentazione e assistenza per gli strumenti GATK e WDL.