Esegui Sentieon® DNASeq®

Sentieon®

Se accedi o utilizzi gli strumenti Sentieon®, accetti di rispettare i termini del Contratto di licenza con l'utente finale di Sentieon®.

Questa pagina spiega come eseguire Sentieon® DNASeq® come pipeline di Google Cloud per l'analisi genomica secondaria. La pipeline corrisponde ai seguenti risultati delle best practice di Genome Analysis Toolkit (GATK) versione 3.7:

• Allineamento
• Ordinamento
• Rimozione duplicati
• Ricollimazione del punteggio di qualità di base (BQSR)
• Chiamata delle varianti

I formati di input includono:

• file fastq
• File BAM allineati e ordinati

Obiettivi

Al termine di questo tutorial saprai come:

• Esegui una pipeline su Google Cloud utilizzando Sentieon® DNASeq®
• Scrivere file di configurazione per diversi casi d'uso di Sentieon® DNASeq®

Costi

In questo documento utilizzi i seguenti componenti fatturabili di Google Cloud:

• Compute Engine
• Cloud Storage

Per generare una stima dei costi in base all'utilizzo previsto, utilizza il Calcolatore prezzi. I nuovi utenti di Google Cloud potrebbero essere idonei per una prova gratuita.

Prima di iniziare

1. Installa Python 2.7 o versioni successive. Per ulteriori informazioni sulla configurazione dell'ambiente di sviluppo Python, ad esempio l'installazione di pip sul sistema, consulta la Guida alla configurazione dell'ambiente di sviluppo Python.
2. Sign in to your Google Cloud account. If you're new to Google Cloud, create an account to evaluate how our products perform in real-world scenarios. New customers also get $300 in free credits to run, test, and deploy workloads.

3. In the Google Cloud console, on the project selector page, select or create a Google Cloud project.

   Note: If you don't plan to keep the resources that you create in this procedure, create a project instead of selecting an existing project. After you finish these steps, you can delete the project, removing all resources associated with the project.

   Go to project selector

4. Make sure that billing is enabled for your Google Cloud project.

5. Enable the Cloud Life Sciences, Compute Engine, and Cloud Storage APIs.

   Enable the APIs

6. In the Google Cloud console, on the project selector page, select or create a Google Cloud project.

   Note: If you don't plan to keep the resources that you create in this procedure, create a project instead of selecting an existing project. After you finish these steps, you can delete the project, removing all resources associated with the project.

   Go to project selector

7. Make sure that billing is enabled for your Google Cloud project.

8. Enable the Cloud Life Sciences, Compute Engine, and Cloud Storage APIs.

   Enable the APIs

9. Install the Google Cloud CLI.

10. To initialize the gcloud CLI, run the following command:

    gcloud init

11. Update and install gcloud components:

    gcloud components update
    gcloud components install beta

12. Installa git per scaricare i file richiesti.

    Scaricare git

13. Per impostazione predefinita, Compute Engine ha implementato quote delle risorse per evitare un utilizzo involontario. Aumentando le quote, puoi avviare più macchine virtuali contemporaneamente, aumentando il throughput e riducendo i tempi di risposta.

    Per ottenere risultati ottimali in questo tutorial, devi richiedere una quota aggiuntiva superiore a quella predefinita del progetto. I consigli per gli aumenti di quota sono riportati nel seguente elenco insieme alle quote minime necessarie per eseguire il tutorial. Invia le richieste di quota nella regione us-central1:

    • CPU: 64
    • Disco permanente standard (GB): 375

    Puoi lasciare vuoti gli altri campi di richiesta di quota per mantenere le quote attuali.

Licenza di valutazione Sentieon®

Quando utilizzi questa pipeline, Sentieon® ti concede automaticamente una licenza di valutazione di due settimane del suo software da utilizzare con Google Cloud. Per ricevere la licenza, inserisci il tuo indirizzo email nel campo EMAIL durante la configurazione della pipeline. Per informazioni sull'impostazione di questo campo, consulta Informazioni sul formato di input.

Per continuare a utilizzare Sentieon® dopo la scadenza della licenza di valutazione, contatta [e-mail].

Configura l'ambiente locale e installa i prerequisiti

1. Se non hai virtualenv, esegui il seguente comando per installarlo utilizzando pip:

   pip install virtualenv

2. Esegui il seguente comando per creare un ambiente Python isolato e installare le dipendenze:

   virtualenv env
   source env/bin/activate
   pip install --upgrade \
       pyyaml \
       google-api-python-client \
       google-auth \
       google-cloud-storage \
       google-auth-httplib2

Scarica lo script della pipeline

Esegui il seguente comando per scaricare i file di esempio e impostare la directory corrente:

git clone https://github.com/sentieon/sentieon-google-genomics.git
cd sentieon-google-genomics

Informazioni sul formato di input

La pipeline utilizza come input i parametri specificati in un file JSON.

Nel repository scaricato è presente un file examples/example.json con i seguenti contenuti:

{
  "FQ1": "gs://sentieon-test/pipeline_test/inputs/test1_1.fastq.gz",
  "FQ2": "gs://sentieon-test/pipeline_test/inputs/test1_2.fastq.gz",
  "REF": "gs://sentieon-test/pipeline_test/reference/hs37d5.fa",
  "OUTPUT_BUCKET": "gs://BUCKET",
  "ZONES": "us-central1-a,us-central1-b,us-central1-c,us-central1-f",
  "PROJECT_ID": "PROJECT_ID"
  "REQUESTER_PROJECT": "PROJECT_ID",
  "EMAIL": "YOUR_EMAIL_HERE"
}

La tabella seguente descrive le chiavi JSON nel file:

Chiave JSON	Descrizione
FQ1	La prima coppia di letture nel file fastq di input.
FQ2	La seconda coppia di letture nel file fastq di input.
BAM	Il file BAM di input, se applicabile.
REF	Il genoma di riferimento. Se impostato, si presume che i file di indicizzazione fastq/BAM esistano.
OUTPUT_BUCKET	Il bucket e la directory utilizzati per archiviare i dati di output della pipeline.
ZONES	Un elenco separato da virgole di zone Google Cloud da utilizzare per il nodo worker.
PROJECT_ID	L'ID del tuo progetto Google Cloud.
REQUESTER_PROJECT	Un progetto da fatturare durante il trasferimento dei dati dai bucket Requester Pays.
EMAIL	Il tuo indirizzo email.

esegui la pipeline.

1. Nella directory sentieon-google-genomics, modifica il file examples/example.json sostituendo le variabili BUCKET, REQUESTER_PROJECT, EMAIL e PROJECT_ID con le risorse pertinenti del tuo progetto Google Cloud:

   {
     "FQ1": "gs://sentieon-test/pipeline_test/inputs/test1_1.fastq.gz",
     "FQ2": "gs://sentieon-test/pipeline_test/inputs/test1_2.fastq.gz",
     "REF": "gs://sentieon-test/pipeline_test/reference/hs37d5.fa",
     "OUTPUT_BUCKET": "gs://BUCKET",
     "ZONES": "us-central1-a,us-central1-b,us-central1-c,us-central1-f",
     "PROJECT_ID": "PROJECT_ID",
     "REQUESTER_PROJECT": "PROJECT_ID",
     "EMAIL": "EMAIL_ADDRESS"
   }

2. Imposta la variabile PROJECT_ID nell'ambiente:

   export PROJECT_ID=PROJECT_ID

3. Esegui il seguente comando per eseguire la pipeline DNASeq® su un piccolo set di dati di test identificato dagli input nel file di configurazione. Per impostazione predefinita, lo script verifica che i file di input esistano nel bucket Cloud Storage prima di avviare la pipeline.

   python runner/sentieon_runner.py --requester_project $PROJECT_ID examples/example.json

Se hai specificato più tentativi preemptibili, la pipeline si riavvia ogni volta che le sue istanze vengono prelevate. Al termine della pipeline, viene visualizzato un messaggio nella console che indica se l'operazione è riuscita o meno.

Configurazione consigliata

Nella maggior parte dei casi, puoi ottimizzare i tempi di risposta e i costi utilizzando la seguente configurazione. La configurazione esegue un genoma umano 30 volte a un costo di circa 1,25 $e richiede circa 2 ore. Un exome umano completo costa circa 0,35 $e richiede circa 45 minuti. Entrambe queste stime si basano sul fatto che le istanze della pipeline non vengono prelevate.

{
  "FQ1": "gs://my-bucket/sample1_1.fastq.gz",
  "FQ2": "gs://my-bucket/sample1_2.fastq.gz",
  "REF": "gs://sentieon-test/pipeline_test/reference/hs37d5.fa",
  "OUTPUT_BUCKET": "gs://BUCKET",
  "BQSR_SITES": "gs://sentieon-test/pipeline_test/reference/Mills_and_1000G_gold_standard.indels.b37.vcf.gz,gs://sentieon-test/pipeline_test/reference/1000G_phase1.indels.b37.vcf.gz,gs://sentieon-test/pipeline_test/reference/dbsnp_138.b37.vcf.gz",
  "DBSNP": "gs://sentieon-test/pipeline_test/reference/dbsnp_138.b37.vcf.gz",
  "PREEMPTIBLE_TRIES": "2",
  "NONPREEMPTIBLE_TRY": true,
  "STREAM_INPUT": "True",
  "ZONES": "us-central1-a,us-central1-b,us-central1-c,us-central1-f",
  "PROJECT_ID": "PROJECT_ID",
  "EMAIL": "EMAIL_ADDRESS"
}

Opzioni aggiuntive

Puoi personalizzare una pipeline utilizzando le seguenti opzioni aggiuntive.

Opzioni file di input

La pipeline supporta più file fastq separati da virgola come input, come mostrato dalla seguente configurazione:

"FQ1": "gs://my-bucket/s1_prep1_1.fastq.gz,gs://my-bucket/s1_prep2_1.fastq.gz",
"FQ2": "gs://my-bucket/s1_prep1_2.fastq.gz,gs://my-bucket/s1_prep2_2.fastq.gz",

La pipeline accetta come input file BAM separati da virgole utilizzando la chiave JSON BAM. Le letture nei file BAM non sono allineate al genoma di riferimento. ma iniziano dalla fase di deduplica dei dati della pipeline. L'esempio seguente mostra una configurazione che utilizza due file BAM come input:

"BAM": "gs://my-bucket/s1_prep1.bam,gs://my-bucket/s1_prep2.bam"

Dati di genoma intero o configurazione di set di dati di grandi dimensioni

Le impostazioni nella configurazione consigliata sono ottimizzate per i campioni del genoma umano sequenziati con una copertura media di 30 volte. Per i file molto più piccoli o più grandi dei set di dati del genoma intero standard, puoi aumentare o diminuire le risorse disponibili per l'istanza. Per risultati ottimali con set di dati di grandi dimensioni, utilizza le seguenti impostazioni:

{
  "FQ1": "gs://sentieon-test/pipeline_test/inputs/test1_1.fastq.gz",
  "FQ2": "gs://sentieon-test/pipeline_test/inputs/test1_2.fastq.gz",
  "REF": "gs://sentieon-test/pipeline_test/reference/hs37d5.fa",
  "OUTPUT_BUCKET": "gs://BUCKET",
  "ZONES": "us-central1-a,us-central1-b,us-central1-c,us-central1-f",
  "PROJECT_ID": "PROJECT_ID",
  "EMAIL": "EMAIL_ADDRESS",
  "DISK_SIZE": 600,
  "MACHINE_TYPE": "n1-highcpu-64",
  "CPU_PLATFORM": "Intel Broadwell"
}

La seguente tabella fornisce una descrizione delle impostazioni utilizzate:

Chiave JSON	Descrizione
DISK_SIZE	Spazio SSD disponibile per il nodo worker.
MACHINE_TYPE	Il tipo di macchina virtuale Compute Engine da utilizzare. Il valore predefinito è n1-standard-1.
CPU_PLATFORM	La piattaforma CPU da richiedere. Deve essere un nome della piattaforma CPU Compute Engine valido (ad esempio "Intel Skylake").

Istanze preemptible

Puoi utilizzare le istanze preemtibili nella pipeline impostando la chiave JSON PREEMPTIBLE_TRIES.

Per impostazione predefinita, il runner tenta di eseguire la pipeline con un'istanza standard se i tentativi preattivabili sono esauriti o se la chiave JSON NONPREEMPTIBLE_TRY è impostata su 0. Puoi disattivare questo comportamento impostando la chiave NONPREEMPTIBLE_TRY su false, come mostrato nella seguente configurazione:

"PREEMPTIBLE_TRIES": 2,
"NONPREEMPTIBLE_TRY": false

La seguente tabella fornisce una descrizione delle impostazioni utilizzate:

Chiave JSON	Descrizione
PREEMPTIBLE_TRIES	Il numero di volte per tentare la pipeline quando si utilizzano istanze preemtibili.
NONPREEMPTIBLE_TRY	Determina se provare a eseguire la pipeline con un'istanza standard dopo che sono stati esauriti i tentativi con prelazione.

Gruppi di lettura

I gruppi di letture vengono aggiunti quando i file fastq vengono allineati a un genoma di riferimento utilizzando Sentieon® BWA. Puoi fornire più gruppi di lettura separati da virgole. Il numero di gruppi di letture deve corrispondere al numero di file fastq di input. Il gruppo di lettura predefinito è @RG\\tID:read-group\\tSM:sample-name\\tPL:ILLUMINA. Per modificare il gruppo di lettura, imposta la chiave READGROUP nel file di input JSON, come показано показано nella seguente configurazione:

"READGROUP": "@RG\\tID:my-rgid-1\\tSM:my-sm\\tPL:ILLUMINA,@RG\\tID:my-rgid-2\\tSM:my-sm\\tPL:ILLUMINA"

La seguente tabella fornisce una descrizione dell'impostazione utilizzata:

Chiave JSON	Descrizione
READGROUP	Un gruppo di lettura contenente metadati di esempio.

Per ulteriori informazioni sui gruppi di lettura, vedi Gruppi di lettura.

Input in streaming da Cloud Storage

Puoi trasmettere in streaming i file fastq di input da Cloud Storage, il che può ridurre il tempo di esecuzione totale della pipeline. Per eseguire lo streaming dei file fastq di input da Cloud Storage, imposta la chiave JSON STREAM_INPUT su True:

"STREAM_INPUT": "True"

La seguente tabella fornisce una descrizione dell'impostazione utilizzata:

Chiave JSON	Descrizione
STREAM_INPUT	Determina se riprodurre in streaming i file fastq di input direttamente da Cloud Storage.

Contrassegno duplicato

Per impostazione predefinita, la pipeline rimuove le letture duplicate dai file BAM. Puoi modificare questo comportamento impostando la chiave JSON DEDUP, come mostrato nella seguente configurazione:

"DEDUP": "markdup"

La seguente tabella fornisce una descrizione dell'impostazione utilizzata:

Chiave JSON	Descrizione
DEDUP	Comportamento dei segni duplicati. Valori validi: La configurazione predefinita rimuove le letture contrassegnate come duplicate. markdup contrassegna i duplicati, ma non li rimuove. nodup salta il contrassegno come duplicato.

Ricollimazione del punteggio di qualità di base (BQSR) e siti noti

BSQR richiede siti noti di variazione genetica. Il comportamento predefinito prevede di saltare questa fase della pipeline. Tuttavia, puoi attivare la ricerca di query basata sui brevetti fornendo ai siti noti la chiave JSON BQSR_SITES. Se specificato, un file DBSNP può essere utilizzato per annotare le varianti di output durante la chiamata delle varianti.

"BQSR_SITES": "gs://my-bucket/reference/Mills_and_1000G_gold_standard.indels.b37.vcf.gz,gs://my-bucket/reference/1000G_phase1.indels.b37.vcf.gz,gs://my-bucket/reference/dbsnp_138.b37.vcf.gz",
"DBSNP": "gs://sentieon-test/pipeline_test/reference/dbsnp_138.b37.vcf.gz"

La seguente tabella fornisce una descrizione delle impostazioni utilizzate:

Chiave JSON	Descrizione
BSQR_SITES	Attiva BSQR e utilizza un elenco separato da virgole dei file forniti come siti noti.
DBSNP	Un file dbSNP utilizzato durante l'identificazione delle varianti.

Intervalli

Per alcune applicazioni, come il sequenziamento mirato o dell'intero esoma, potresti essere interessato solo a una parte del genoma. In questi casi, fornire un file di intervalli target può velocizzare l'elaborazione e ridurre le chiamate di varianti fuori target di bassa qualità. Puoi utilizzare gli intervalli con le chiavi JSON INTERVAL_FILE e INTERVAL.

"INTERVAL_FILE": "gs://my-bucket/capture-targets.bed",
"INTERVAL": "9:80331190-80646365"

La seguente tabella fornisce una descrizione delle impostazioni utilizzate:

Chiave JSON	Descrizione
INTERVAL_FILE	Un file contenente intervalli genomici da elaborare.
INTERVAL	Una stringa contenente un intervallo genomico da elaborare.

Opzioni di output

Per impostazione predefinita, la pipeline produce un BAM pre-elaborato, le metriche di controllo qualità e le chiamate delle varianti. Puoi disattivare uno di questi output utilizzando le chiavi JSON NO_BAM_OUTPUT, NO_METRICS e NO_HAPLOTYPER. Se l'argomento NO_HAPLOTYPER non viene fornito o è NULL, puoi utilizzare la chiave JSON GVCF_OUTPUT per produrre chiamate di varianti in formato gVCF anziché VCF.

"NO_BAM_OUTPUT": "true",
"NO_METRICS": "true",
"NO_HAPLOTYPER": "true",
"GVCF_OUTPUT": "true",

La seguente tabella fornisce una descrizione delle impostazioni utilizzate:

Chiave JSON	Descrizione
NO_BAM_OUTPUT	Determina se generare un file BAM pre-elaborato.
NO_METRICS	Determina se generare le metriche dei file di output.
NO_HAPLOTYPER	Determina se stampare le chiamate alle varianti.
GVCF_OUTPUT	Determina se le chiamate alle varianti devono essere generate in formato gVCF.

Versioni di Sentieon® DNASeq®

Puoi utilizzare qualsiasi versione recente del pacchetto software Sentieon® DNASeq® con l'API Cloud Life Sciences specificando la chiave JSON SENTIEON_VERSION, ad esempio:

"SENTIEON_VERSION": "201808.08"

Sono valide le seguenti versioni:

• 201711.01
• 201711.02
• 201711.03
• 201711.04
• 201711.05
• 201808
• 201808.01
• 201808.03
• 201808.05
• 201808.06
• 201808.07
• 201808.08

Esegui la pulizia

Al termine del tutorial, puoi eliminare le risorse che hai creato su Google Cloud in modo che non ti vengano addebitate in futuro. Le seguenti sezioni descrivono come eliminare o disattivare queste risorse.

Elimina il progetto

Il modo più semplice per eliminare la fatturazione è quello di eliminare il progetto utilizzato per il tutorial.

Per eliminare il progetto:

Avviso: l'eliminazione di un progetto ha le seguenti conseguenze:

• Se hai utilizzato un progetto esistente, eliminerai anche tutto il lavoro effettuato nel progetto.
• Non puoi riutilizzare l'ID di un progetto eliminato. Se hai creato un ID personalizzato che hai intenzione di utilizzare in futuro, elimina le risorse all'interno del progetto. Questo passaggio garantisce che gli URL che utilizzano l'ID del progetto, ad esempio un URL appspot.com, rimangano disponibili.

Se stai esplorando più tutorial e guide di avvio rapido, puoi riutilizzare i progetti invece di eliminarli, in modo da non superare i limiti di quota.

1. Nella console Google Cloud, vai alla pagina Progetti.

   Vai alla pagina Progetti

2. Nell'elenco dei progetti, selezionare quello da eliminare e fai clic su Elimina progetto.
3. Nella finestra di dialogo, digita l'ID del progetto e fai clic su Chiudi per eliminare il progetto.

Passaggi successivi

• Se hai domande sulla pipeline o riscontri problemi, invia un'email all'indirizzo [e-mail].